如何運用生物化學(xué)方法檢測細胞凋亡？

本期小編帶來(lái)細胞凋亡的生物化學(xué)檢測方法。

一、Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測方法

原理：在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內側，細胞發(fā)生凋亡最早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內側翻向外側，這一變化早于細胞皺縮、染色質(zhì)濃縮、DNA的片斷化和細胞膜的通透性增加等凋亡現象。

AnnexinV是一種磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過(guò)細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此AnnexinV被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。 

碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細胞膜，但凋亡中晚期的細胞和死細胞由于細胞膜通透性的增加，PI能夠透過(guò)細胞膜而使細胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細胞區分開(kāi)來(lái)。 

因此，將Annexin V與PI聯(lián)合使用時(shí)，PI 則被排除在活細胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時(shí)被FITC 和PI 結合染色呈現雙陽(yáng)性（Annexin V+/PI+）。這里推薦ZETA LIFE的Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒，實(shí)驗操作中效果相當不錯。

檢測方法：1.按照既定程序誘導細胞凋亡；2.按照說(shuō)明書(shū)配制所需溶液；3.常規制備單細胞懸液，用冷PBS洗兩次后，取約5×106個(gè)細胞，1500rpm離心，棄上清，將細胞懸浮在400 µl×結合溶液中；4.將細胞懸液分成5管，每管約1×106個(gè)細胞，陰性對照管不加任何試劑，陽(yáng)性對照管加2%多聚甲醛固定30分鐘，用FITC標記Annexin V和PI雙染，余下3管，其中1管只加10 µl PI，1管只加5 µl FITC標記Annexin V，最后一管加10 µl PI和FITC標記Annexin V混合，室溫孵育15分鐘；5.每管各加400 µl 1× 結合緩沖液上機檢測。

注意事項：A.確定細胞凋亡發(fā)生的時(shí)間，PS外翻只發(fā)生在細胞凋亡早期，建議先觀(guān)察細胞凋亡的形態(tài)后決定取樣檢測時(shí)間；B.由于EDTA會(huì )絡(luò )合Ca2+離子，影響Annexin V與PS的結合，因此建議不用含EDTA的胰酶消化貼壁細胞。細胞經(jīng)過(guò)胰酶消化后可能導致胰酶對細胞的進(jìn)一步作用從而導致細胞的進(jìn)一步凋亡，建議在用胰蛋白酶處理前單獨收集培養液中懸浮的細胞，保存在2%的BSA中。

二、磷脂酰絲氨酸單抗（PS）檢測法

原理：與Annexin V相比，PS的抗體可以直接用來(lái)檢測細胞凋亡過(guò)程中PS的外翻，而且靈敏度高，特異性強，信號持續時(shí)間久，費用更低。

三、TUNEL法

原理：TUNEL的全稱(chēng)是Terminal Deoxynucleotidyl Transferase mediated dUTP Nick-End Labeling，中文名為末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP原位切口末端標記。

細胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個(gè)漸進(jìn)的分階段的過(guò)程，染色體DNA首先在內源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30 ﹪的染色體DNA在Ca 2+和Mg2+依賴(lài)的核酸內切酶作用下，在核小體單位之間被隨機切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3’-末端，從而可進(jìn)行凋亡細胞的檢測，這類(lèi)方法一般稱(chēng)為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）。

由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒(méi)有DNA的斷裂，因而沒(méi)有3’-OH形成，很少能夠被染色。低分子量的DNA分離后，也可使用DNA聚合酶進(jìn)行缺口翻譯（nick translation），使低分子量的DNA標記或染色，然后分析凋亡細胞。

TUNEL或缺口翻譯法實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結合的研究方法，對完整的單個(gè)凋亡細胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準確的反應細胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞凋亡測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，靈敏度遠比一般的組織化學(xué)和生物化學(xué)測定法要高，因而在細胞凋亡的研究中已被廣泛采用。

不足之處：

(1)壞死細胞亦有DNA裂點(diǎn)形成,也可呈現TUNEL反應陽(yáng)性，因而特異性較差。據報道，TUNEL反應中壞死細胞的標記量比凋亡細胞的標記量少一個(gè)數量級。

(2)TUNEL結合免疫組化檢測時(shí)，固定過(guò)程對檢測的影響較大，切片的大小、薄厚會(huì )直接影響到固定效果，從而產(chǎn)生結果的差異。

四、ISOL檢測法

原理：與TUNEL凋亡檢測法類(lèi)似，ISOL（In Situ Oligo Ligation，原位寡核苷酸片段連接）也是通過(guò)末端標記斷裂DNA的方法。但該方法的創(chuàng )新在于利用ISOL方法，在DNA的片段的平端或3’端單個(gè)突出堿基進(jìn)行連接擴增，鑒于只有發(fā)生凋亡的細胞才會(huì )發(fā)生平端或3’端單個(gè)堿基突出，所以ApopTag 過(guò)氧化物酶ISOL凋亡檢測試劑盒能夠明確的區分凋亡細胞和壞死細胞。

優(yōu)勢：原位特異標記，能夠最大限度的降低背景，克服TUNEL法檢測的假陽(yáng)性，適用于石蠟包埋的組織、冰凍組織、貼壁細胞以及懸浮細胞的凋亡檢測。

五、DNA凝膠電泳(DNAladder) 

凋亡過(guò)程中DNA裂解是標志細胞最終走向死亡的不可逆的重要過(guò)程，DNA凝膠電泳也曾被認為是細胞凋亡判定的金標準之一。抽提細胞的DNA,確定樣品中DNA的量和純度，然后在瓊脂糖凝膠上電泳。正?；罴毎腄NA凝膠電泳為一條區帶;細胞凋亡時(shí)，由于DNA被裂解成單個(gè)核小體和寡聚核小體，電泳時(shí)呈現特征性的“階梯狀"(ladder)條帶，壞死細胞的DNA是被隨機破壞的，不能形成階梯狀條帶，電泳時(shí)出現類(lèi)似血涂片的連續性改變。此方法是判斷細胞有無(wú)凋亡發(fā)生的一種簡(jiǎn)便方法，比較適用于體外培養的非增殖性細胞的檢測。

缺點(diǎn)：

(1)特異性較差，特征性的180～200bpDNA梯帶的出現并非凋亡所有，另外在某些罕見(jiàn)的情況下細胞發(fā)生凋亡可無(wú)DNA斷裂；

(2)不能提供單個(gè)細胞或相關(guān)細胞的組織學(xué)定位或細胞分化等凋亡信息；

(3)不能進(jìn)行準確定量，只能進(jìn)行半定量；

(4)靈敏性較差，要求所測標本細胞數在1×106以上才能使電泳清晰；

(5)適用于只含有單一細胞成分標本的測定，對組織細胞組成復雜者，不能確定凋亡發(fā)生于哪類(lèi)細胞。

六、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）核小體測定

ELISA是定量檢測細胞凋亡的免疫化學(xué)法，其基本原理是利用夾心ELISA方法檢測細胞凋亡后形成的由組蛋白及DNA的片斷組成的核小體。在微定量板上吸附抗組蛋白抗體，加入細胞裂解后離心所得的含有核小體的上清液，核小體上的組蛋白與包被的抗組蛋白抗體結合；加入辣根過(guò)氧化物酶標記的抗DNA抗體，與核小體上的DNA結合；加酶的底物，測光吸收值。此方法敏感性高，所需細胞數少，可檢測低至5×102/mL的凋亡細胞。此外，此方法不需特殊儀器，比較適合基層工作。

缺點(diǎn)：

(1)不能精確測定凋亡發(fā)生的絕對量；

(2)適合單一成分細胞的檢測，對于多細胞成分的組織或細胞混合物，不能判定凋亡發(fā)生在哪種細胞；

(3)不能提供單個(gè)細胞或相關(guān)細胞的組織學(xué)定位。