細胞自噬的實(shí)驗方法詳解

自噬（autophagy）被認為是維持細胞穩態(tài)的關(guān)鍵過(guò)程，也是對等壓力源的反應，如營(yíng)養缺乏，這可能會(huì )危及細胞的生存。當細胞接觸到這些壓力源時(shí)，原本在低水平發(fā)生以平衡生物分子的恒定合成的自噬，就會(huì )被大幅度上調。這種上調會(huì )增加了細胞的吸收和降解，將大分子釋放回胞質(zhì)中以驅動(dòng)必須的代謝反應并產(chǎn)生能量。

在正常和壓力條件下，自噬對細胞健康的貢獻，意味著(zhù)這種嚴格調控和精確協(xié)調過(guò)程的重要生理和病理作用。事實(shí)上，自噬在哺乳動(dòng)物的發(fā)育過(guò)程中被發(fā)現是有用的。此外，最近的研究發(fā)現自噬是各種疾病和病癥的重要調節器。探索自噬在發(fā)育和疾病中的參與，對于更全面地了解這一途徑的作用至關(guān)重要，并且可能對保持健康或治療疾病有影響。

自噬的研究已經(jīng)成為如今醫學(xué)研究的?？?，發(fā)文量也十分巨大，成為常規生物學(xué)現象來(lái)研究，但是有一些實(shí)驗上的技巧值得探討一二，例如一些試劑的使用等等

1、自噬相關(guān)試劑的使用。

①MDC:取12 mg粉末溶于720 nl DMSO使其濃度為50 mmol/L,分裝后-20冰箱保存。臨用前用MEM稀釋到終濃度50 umol/L;

②Rapamycin:用MEM培養基配成終濃度為1 umol/L,現用現配;

400ng/ml喹乙醇:稱(chēng)取4 mg喹乙醇,DMSO預溶(體積<0.1%)后加入10 ml MEM培養液至*溶解,現用現配,避光保存;

③3-MA:首先用PBS溶解粉末,臨用前加熱至*溶解后再加入MEM培養基至終濃度10mmol/L;PI3K抑制劑（3-MA，Wortmannin）可干擾或阻斷自噬體的形成；

用RAPAMYCIN誘導自噬我也查過(guò)一部分文獻，有用無(wú)血清的，也有用，一般培養基的，濃度從25nM到100nM都有，用的是50nM的雷帕霉素，加入一般的培養基中，目的是排除無(wú)血清所誘導出來(lái)的自噬。

 文獻說(shuō)饑餓初期激活的是大分子自噬，在4-6小時(shí)活力達到最大，24h后以CMA途徑為主

④Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 h

sigma的EBSS，貨號E2888，有碳酸氫鈉，有酚紅的，酚紅到不是很必須，只是一個(gè)PH指示作用，好看些

⑤無(wú)血清誘導自噬：EBSS 誘導6個(gè)小時(shí)就可以了。

EBSS一定可以誘導出來(lái)，只是需要說(shuō)明的是時(shí)間點(diǎn)的設置，因為從饑餓誘導開(kāi)始半個(gè)小時(shí)就可能開(kāi)始自噬了，一直到24小時(shí)都持續，所以應該設置不同的時(shí)間點(diǎn)觀(guān)察這個(gè)作用。另外一個(gè)很大的問(wèn)題是，饑餓誘導的一個(gè)很大的弊端是細胞死亡，這也是我面臨的問(wèn)題，就是在細胞收養的時(shí)候蛋白濃度太小了。24小時(shí)就很少了，更不要說(shuō)48小時(shí)和72小時(shí)了。

⑥Hank's誘導，也就是通常所說(shuō)的饑餓誘導，細胞培養到對數生長(cháng)期后以Hank's替代常規*培養基，3h后就可誘導出自噬。我用Hank's誘導了3h后電鏡觀(guān)察有30%細胞都有自噬這種現象，但不如國外報道的高。

⑦sigma的氯喹的貨號C6628。用氯喹做自噬抑制劑，293T細胞50uM就可以。1. 可以用雙蒸水配制2. 配制后4度保存

不同的自噬抑制劑機制不同。抑制的步驟也不同。有的不能抑制lc3的剪切，但能抑制后續的步驟，Chloroquine抑制自噬體與溶酶體的融合過(guò)程，autophgy不能完成，所以lc3才會(huì )累積。因此加了抑制劑lc3之后會(huì )比不加的要高。氯喹能提高溶酶體中的pH值，使溶酶體中的酸性水解酶喪失活性，從而導致“自噬溶酶體"不能降解，因此，位于自噬體和自噬溶酶體膜上的LC3不能按時(shí)降解，表現為L(cháng)C3熒光長(cháng)時(shí)間的保留或WB中LC3條帶變粗。

⑧Z-VAD-FMK（caspase-3 抑制劑）抑制EV71感染所引起的細胞凋亡，觀(guān)察細胞的自噬情況。研究發(fā)現，抑制細胞凋亡能增加LC3-I轉化為L(cháng)C3-II以及p62的降解。

1.   雷帕霉素：作為以mTOR 為靶點(diǎn)較為經(jīng)典的誘導劑已經(jīng)被廣為應用，推薦工作濃度為1μmol-10μmol；

 2.   氯喹：氯喹（Chloroquine）作為溶酶體的抑制劑，可以抑制自噬體與溶酶體的融合從而可以用來(lái)作為自噬以及自噬流的抑制劑用于實(shí)驗研究，推薦使用濃度：10umol-50umol。

2、自噬誘導劑

 正常培養的細胞自噬活性很低，不適于觀(guān)察，因此，必須對自噬進(jìn)行人工干預和調節，經(jīng)報道的藥物有：

(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模擬內質(zhì)網(wǎng)應激

 (2) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化鋰）：IMPase抑制劑（即Inositol monophosphatase，肌醇單磷酸酶）

 (3) Earle's平衡鹽溶液：制造饑餓

 (4) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制劑

 (5) Rapamycin：mTOR抑制劑

 (6) Xestospongin B/C：IP3R阻滯劑

3、自噬抑制劑

 (1) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K）hVps34 抑制劑

 (2) Bafilomycin A1：質(zhì)子泵抑制劑

 (3) Hydroxychloroquine（羥氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶體腔堿化劑）

衣霉素(tunicamycin from Slreptomyces sp., TM). Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品,貨號:T7765 ;溶于DMSO中配成儲存液,使用時(shí)DMSO終體積濃度不超過(guò)1/1000。

3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA). Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品,貨號:M9281;溶于滅菌超純水制成儲存液。

氯喹二磷酸鹽(chloroquine diphosphate salt,CQ) sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品,貨號:C6628;溶于滅菌超純水中制成存液。

雷帕霉素(rapamycin), 2.5mg/ml in DMSO, Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品,貨號:R8781;

4、MDC染色焚光顯微鏡檢測細胞自睡

單丹黃酰尸胺(Monodansylcadaverine,MDC)是一種突光染料,被用作自吞泡的示蹤劑。具體操作步驟如下:

(1)將處于對數生長(cháng)期的HepG2細胞按常規方法消化后接種于6孔板,每孔接種1x106個(gè)細胞;

(2)細胞密度達到60%-70%時(shí),棄去培養液,小心用PBS洗1遍,分別用含TG濃度為0、0.5、1 nM的培養基及含Rapamycin (終濃度1 pM)的培養基繼續培養24 h;

(3)棄上清PBS洗2遍,每孔加入含MDC(終濃度50 nM)的培養基于37 V、5% CCh的恒溫培養箱中避光溫育20 min;

(4)取出六孔板置于勞光顯微鏡下,Ih內觀(guān)察細胞自唾發(fā)生情況并拍照。

5、流式細胞術(shù)檢測細胞自噬發(fā)生率

(1)取對數生長(cháng)期的HepG2細胞,接種于6孔板,培養24h之后,分別用含TG濃度為0、1、2、4、8uM的培養基繼續培養24h和0.5uM的TG作用不同時(shí)間(0、24、36、48、60h)后,取出六孔板,將上清收集到4 ml的離心管中;

(2)每孔加入2ml含MDC(終濃度50nM)的MEM培養基,于37°C、5%0?的恒溫培養箱中避光孵育30 min;

(3)將收集的上清2000rpm,離心5min;

(4)棄掉上清,每管加入500ul含MDC(終濃度50 uM)的MEM培養基,吹打混句,37 °C避光解育30 min;

(5)取出六孔板,PBS洗2次,0.25%的胰酶消化2min, 1 ml的PBS吹打混勻收集到1.5ml的離心管中,2000 rpm.離心5 min;

(6)棄掉上清,加1ml的PBS重懸,2000rpm,離心5 min;

(7)吸出800ul上清,剩余的200 ul吹打混勾;

(8)鮮育完的上清,2000rpm,離心5 min;

(9)棄掉上清,1ml的PBS吹打混勾收集到1.5 ml的離心管中,2000 rpm,離心5 min;

(10)重復步驟(6)和(7);

(11)將上述兩個(gè)相同濃度或相同時(shí)間點(diǎn)的兩管混勾,過(guò)300目銅網(wǎng)上機檢測。流式細胞

儀以488nm激發(fā)波長(cháng)測定MDC染色的熒光強度。

LC3B WB: 1:2000

條件是15% SDS-PAGE, 正常跑膠至下沿0.5cm即可，200mA 濕轉45min 正常0.45的PVDF，5%牛奶封閉1h，4C過(guò)夜搖動(dòng)孵育，洗抗體3*5min即可

LC3B的Western-blot檢測，配置的15%的分離膠，濕轉250mA，60min

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