解答流式細胞凋亡檢測疑難

1、Q：rh Annexin V R-PE 20 tests是BD公司用于凋亡流式檢測的試劑盒，產(chǎn)品顯示種屬為人，請問(wèn)能否用于大鼠細胞的檢測？

A：可以。因為Annexin V是與PS親和，而PS在不同種屬間應該沒(méi)差異。在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內側翻向外側。Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴(lài)性磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過(guò)細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。將Annexin V進(jìn)行熒光素（FITC）標記，以標記了的Annexin V作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發(fā)生。

2、Q：用流式作細胞凋亡為什么跟tunel差別那么大??？？tunel測出來(lái)的細胞凋亡率大概有30%而作流式測出來(lái)的凋亡率只有2%（陰性對照0.5%）差別好大啊，用的是beckman公司的Annexin V /PI雙染試劑盒，實(shí)驗步驟如下：

（1）胰酶消化貼壁細胞，加培養基中止，離心1000轉5min

（2）吸去上清，PBS0.5ml 重懸細胞（因為要送到別處作流式，期間路程約1h，戶(hù)外溫度約37度）

（3）然后加入Annexin V /PI各5微升，避光20min，上機。

請問(wèn)這是什么原因導致的？

A：我也用這兩種方法做過(guò)凋亡，是存在兩種方法測的凋亡率差別有點(diǎn)大，但還沒(méi)有大到你這樣的程度。雙染測的是凋亡的早期事件PS外翻。TUNEL測的是凋亡最晚期的事件DNA的片段化。而且TUNEL在檢測過(guò)程中，把操作損傷細胞和壞死細胞當作了凋亡細胞，而且如果TUNEL是肉眼計數的話(huà)，也會(huì )有判斷上的誤差，所以，往往TUNEL作出來(lái)的凋亡率高一點(diǎn)。但如果凋亡率達到30%，ladder估計也應該跑的出來(lái)。雙染雖然是機器操作，但在調試補償時(shí)，人為的影響還是挺明顯的，也不是特別的客觀(guān)?；€(xiàn)稍微左移，你的凋亡率就成倍上升。所以，給你的建議是在經(jīng)費、時(shí)間允許的范圍內再多做幾次吧。感覺(jué)這么大的差異，可能這兩種方法都會(huì )存在問(wèn)題。還有，去流式的路上，裝細胞的ep管最好插在冰上，拿著(zhù)冰盒。

3、Q：可以用液氮保存瘤組織塊，然后再做流式細胞分析嗎？

A：我認為是不能的。因為流式細胞分析要求細胞分散、單個(gè)，活性好，這樣才能區分死亡、凋亡和活性細胞。組織在凍存、復溫的過(guò)程中會(huì )有大量的細胞死亡，同時(shí)經(jīng)過(guò)這一過(guò)程的組織在分離成單個(gè)細胞的時(shí)候會(huì )形成許多細胞碎片，不宜上流式檢測了，所以用于流式檢測的標本最好是新鮮標本，即取材后立即檢測，效果最（女子）。

我以前也試圖將組織存入-80℃，然后進(jìn)行流式檢測，結果發(fā)現后來(lái)處理的組織細胞不是粘團就是破碎，根本無(wú)法檢測。如果你實(shí)在找不到可以檢測的流式細胞儀，我建議你可以將組織標本進(jìn)行切片，然后做原位染色，觀(guān)察組織細胞的凋亡。

我們實(shí)驗室的腫瘤組織塊一部分凍存于液氮用于以后提蛋白做Western或提RNA做RT-PCR，另一部分用10%的甲醛固定用于以后做免疫組化。

4、Q：有關(guān)流式前收集細胞的問(wèn)題1、貼壁細胞做流式前用胰酶消化下來(lái)對細胞膜損傷小還是用細胞刮刮下來(lái)?yè)p傷??？種在板里的貼壁細胞可以先染PI然后再消化下來(lái)嗎？這樣是否可以減小由于消化液造成的細胞膜破損而染上的PI的誤差？

A：我想做NK細胞對腫瘤細胞的殺傷實(shí)驗，用MTT做了很多回，但只有NK細胞的對照組OD值就和腫瘤對照組差不多高了，這樣NK細胞殺傷腫瘤細胞后自身的變化對抑制率的影響會(huì )很大，所以想用流式來(lái)測腫瘤細胞的凋亡。我擔心胰酶消化會(huì )造成細胞膜的損傷，這樣就會(huì )有一些細胞因消化的原因染上PI，所以想嘗試先染PI，洗掉多余的PI后再用胰酶把細胞消化下來(lái)，不知道可不可以。低濃度胰酶消化，輕柔吹打貼壁細胞2～3次，吊桶式離心機4度1000rpm 3～5min離心，處理得當的話(huà)，胰酶造成損傷可以控制在5%以?xún)?，有對照組的情況下對實(shí)驗結果不會(huì )造成明顯影響。而先加PI不僅染色是否每組都均勻充分很難判斷，而且PI本身對細胞也是有毒性的，對你的實(shí)驗結果影響會(huì )比胰酶大，個(gè)人不建議這樣做。

5、Q：做流式細胞過(guò)程中，由于不能用胰酶消化貼壁細胞，還有其他什么方法嗎？由于293細胞貼壁能力很強，現在要做流式，要把貼在培養皿壁上的細胞消化下來(lái)。但又不能用胰酶消化，我試著(zhù)用1毫升的1mM的EDTA消化20min，結果細胞很難消化下來(lái)。最后，去做流式檢測結果很差。不知道還有其他什么更好的消化方法，但又不破壞細胞膜的表面結構。

A：不是不能用胰酶消化是不能用含有EDTA的胰酶消化，因為annexinV是Ca依賴(lài)的蛋白，所以不能加入EDTA， 防止EDTA螯合了Ca離子從而影響annexinV，進(jìn)而影響結果。所以你可以用不含EDTA的胰酶，放入溫箱內進(jìn)行消化，時(shí)間可以長(cháng)一點(diǎn)，隨時(shí)觀(guān)察細胞情況，避免消化過(guò)度。建議用細胞刮子把細胞刮下來(lái)，然后用槍吹勻，比消化還簡(jiǎn)單，而且也避免了胰酶帶來(lái)的損傷，機械的損傷還是很小的因為細胞大多呈大片大片地被刮下來(lái)。

6、Q：流式測凋亡為何左上象限出奇的高？

A：看了你的數據，我覺(jué)得第一跟你的細胞狀態(tài)很有關(guān)系，你說(shuō)對照組中間也有很多死細胞，而且你做實(shí)驗時(shí)也吸上來(lái)了，壞死的細胞和凋亡的細胞是不一樣的，如果細胞壞死破裂很多的話(huà)這時(shí)左上象限PI就很高了，再則，PI染的時(shí)間5-10分鐘就可以了。我做的時(shí)候是采用PI和Annexin V分開(kāi)染，PI先染或離心去掉染液，然后再加結合液和Annexin V10分鐘后上機檢測。PBS洗的目的有利于A(yíng)nnexin V的結合反應，為了縮短實(shí)驗時(shí)間和較少細胞損失，我一般也就洗一次。最后，我個(gè)人的觀(guān)點(diǎn)是做實(shí)驗時(shí)，細胞狀態(tài)一定要好的情況下去做，不要勉強，這一既浪費試劑和時(shí)間，也往往得不到好的可靠的結果。你做的是貼壁細胞，中間有好多死的細胞，你可以先接種細胞，待細胞貼壁好了，然后再換一次液，這樣就把那些死細胞去掉，接下來(lái)再加藥物。

7、Q：請教做流式細胞儀檢測細胞凋亡，那種方法比較好？也比較經(jīng)濟實(shí)惠？Annexin V/PI雙染色法和Hoechst/PI雙染法哪種更好一點(diǎn)？

A：Hoechst/PI染色在流式分析中并不常見(jiàn)。Hoechst需要紫外激發(fā)，因此只有在配備了相應激發(fā)光源的流式細胞儀上才能使用。我的印象中，不少地方的分選用流式為了用Hoechst分析sp表型的干細胞，配備了此激發(fā)光源，但是普通的分析用流式，多半是沒(méi)有配備的。

8、Q：流式細胞儀檢測凋亡如何算是否有統計學(xué)意義？

A：用流式檢測凋亡時(shí)，PI受時(shí)間的影響很大，因標記了PI后會(huì )加大細胞毒性，隨著(zhù)時(shí)間延長(cháng)會(huì )導致PI的染色增加，特別是檢測早期凋亡時(shí)，如果時(shí)間延長(cháng)除了會(huì )導致在流式細胞儀上的細胞分群差距加大外，誤差會(huì )明顯加大。一般的說(shuō)明書(shū)都會(huì )標明，PI在上機前5分鐘加，然后在一個(gè)小時(shí)內檢測。根據以前做流式凋亡時(shí)的經(jīng)驗，我個(gè)人認為，一般每組實(shí)驗一次可以先做三個(gè)復孔，上機前5分鐘加PI，最好在半小時(shí)內檢測完畢。這時(shí)可以先分析下三個(gè)復孔的差異。等待摸索的實(shí)驗條件成熟后，每組實(shí)驗一次可以做6~8個(gè)復孔，然后做統計學(xué)分析。嚴格說(shuō)來(lái)，當做出統計學(xué)差異時(shí)，這樣的實(shí)驗還要重復三次。但是因檢測凋亡時(shí)，受細胞狀態(tài)，PI染色時(shí)間，流式檢測時(shí)間，以及每次實(shí)驗時(shí)的誤差等的影響外，很難保證能夠*重復出上次的結果，甚至即使在保證了實(shí)驗條件幾乎相同的情況下，每次重復的差異也會(huì )出現加大的情況。這時(shí)可以適當重復2~3次，盡量使差異減小。

9、Q：如何用Hoechst33342/PI流式檢測凋亡？

A：標記完以后，若用流式檢測，壞死細胞與凋亡細胞的峰形是不一樣的，壞死細胞呈反拋物線(xiàn)，而凋亡細胞呈正常，應是雙曲線(xiàn)吧，很容易區分的。關(guān)于PI與Hoechst33342作用：PI、Hoechst33342均可與細胞核DNA（或RNA）結合。但是PI不能通過(guò)正常的細胞膜，Hoechst則為膜通透性的熒光染料，故細胞在處于壞死或晚期調亡時(shí)細胞膜被破壞，這時(shí)可為PI著(zhù)紅色。正常細胞和中早期調亡細胞均可被Hoechst著(zhù)色，但是正常細胞核的Hoechst著(zhù)色的形態(tài)呈圓形，淡蘭色，內有較深的蘭色顆粒；而調亡細胞的核由于濃集而呈亮蘭色，或核呈分葉，碎片狀，邊集。故PI著(zhù)色為壞死細胞；亮蘭色，或核呈分葉狀，邊集的Hoechst著(zhù)色的為調亡細胞。

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