怎么預防支原體——看米高梅科學(xué)家怎么說(shuō)（上）

這篇文章Kaustubh Kishor Jadhav撰寫(xiě)的，今天先分享的是他的上一段，關(guān)于細胞支原體污染的原因和怎么檢測細胞支原體污染，他是米高梅生物科學(xué)與技術(shù)研究所的研究助理。

如果你正在閱讀這篇文章，如果你的實(shí)驗室里有支原體，不要驚訝。因為它們存在于大多數細胞培養設施、組織培養實(shí)驗室中，是每個(gè)細胞培養工作者必須解決的問(wèn)題。據估計，高達60%的細胞培養污染是支原體污染（Uphoff，2002年統計）。

支原體被認為是最是簡(jiǎn)單、最小的細菌之一。缺乏堅硬的細胞壁使它們對抗生素和抗菌藥物如青霉素和鏈霉素產(chǎn)生耐藥性。支原體可以通過(guò)過(guò)濾器，因為它能夠變成任何形狀以黏附在細胞壁上。

支原體污染的原因

支原體通過(guò)各種難以追蹤的來(lái)源進(jìn)入細胞培養。這些包括實(shí)驗室人員、血清、細胞培養基、水浴、培養箱等。人類(lèi)支原體污染是上述污染的最大來(lái)源。污染物可以通過(guò)臟衣服、實(shí)驗服、以及層流氣流附近的會(huì )語(yǔ)、頭皮屑、打噴嚏、咳嗽等傳播。此外，無(wú)論在哪里保存細胞培養物，持續不斷的個(gè)體流動(dòng)都會(huì )增加污染的風(fēng)險。

由于實(shí)驗室的設備落后以及節約成本等原因，支原體可以通過(guò)交叉污染從這些來(lái)源傳播，這包括對多個(gè)細胞系重復使用移液管，而不是使用一次性移液管或重復使用手套。血清也是支原體污染的來(lái)源。由于其渾濁的性質(zhì)，污染是很難檢測到的血清，這是較為常用的每種細胞培養。重復使用同一瓶血清可促進(jìn)支原體的生長(cháng)。血清營(yíng)養豐富，也是支原體增殖的最佳來(lái)源。另外，它是在高壓滅菌后添加到培養基中的，因此，不能保證血清無(wú)污染。

在層流氣流倉中工作時(shí)（說(shuō)話(huà)或移液時(shí)）產(chǎn)生的氣溶膠也是造成污染的主要原因之一。在傳代培養過(guò)程中，這些產(chǎn)生的氣溶膠將進(jìn)入培養基，如果細胞系暴露時(shí)間較長(cháng)，這些氣溶膠將從空氣中進(jìn)入細胞。這些氣溶膠肉眼看不見(jiàn)，因此在導致污染之前無(wú)法被檢測到。

問(wèn)題的另一個(gè)來(lái)源是用于傳代培養的培養基，它有液體和粉末兩種形式。由于處理不當或實(shí)驗室環(huán)境不好，支原體可以通過(guò)這種粉狀培養基傳播。過(guò)濾不能確保*滅菌，因為支原體甚至可以逃逸0.2微米的過(guò)濾器。

支原體可以在干燥狀態(tài)下保持較長(cháng)時(shí)間。當它們接觸到營(yíng)養源時(shí)，很快就會(huì )開(kāi)始增殖。一旦它們出現在實(shí)驗室環(huán)境中，就很難*。你可以抑制支原體的生長(cháng)，但不能**它。當支原體出現在培養基中時(shí)，丟棄培養源是一個(gè)很好的選擇（除非培養源不可替代或價(jià)格昂貴）。

怎么檢測細胞支原體

用肉眼或光學(xué)顯微鏡檢測支原體是非常困難的，那么你怎么知道它在那里呢？您可以使用PCR的檢測、DNA染色、熒光標記、瓊脂平板等。明智地選擇下面列出的任何一種技術(shù)，并始終使用第二次分析來(lái)確定。在檢測支原體之前，細胞應連續培養至少兩周，以便有時(shí)間讓低濃度的污染物生長(cháng)。對于試驗，取樣前至少兩天或三天不應更換培養基（Uphoff和Drexler，2011）。

軟瓊脂培養被認為是檢測支原體的“金標準"。在這種方法中，細胞培養的上清液被加入液體或半固體培養基（含有支原體生長(cháng)所必需的營(yíng)養素）。受感染的細胞在含有培養基的瓊脂平板上都會(huì )生長(cháng)。支原體菌落在瓊脂平板上很容易看到。除少數支原體外，該方法能檢測大多數支原體。

另一種用于支原體檢測的方法是PCR。在這項技術(shù)中，針對各種常見(jiàn)感染支原體的16sRNA基因的PCR引物被使用。廣泛的引物包含幾乎所有可感染的支原體。過(guò)程中使用的引物要么是物種/基因特異性的，要么是通用的。該方法快速、高效、可靠且效益高（Sung，2006）。

顯色法檢測細胞支原體。一旦檢測到支原體，試劑就會(huì )引發(fā)一系列的化學(xué)反應，從而引起明顯的顏色變化。該方法靈敏度高，特異性低（Degeling，2012）。

生物發(fā)光檢測試劑盒可從不同的生物技術(shù)公司獲得，這些公司是基于酶的支原體檢測試劑盒。這些試劑盒檢測的支原體酶不是由真核細胞合成。首先，試劑盒的成分使支原體破裂，然后使用特定的酶來(lái)觸發(fā)產(chǎn)生發(fā)光的細胞機制，然后通過(guò)光度計檢測到。

感染培養基中可加入非特異性DNA染色劑檢測支原體。當在熒光顯微鏡下觀(guān)察時(shí)，支原體DNA除了細胞DNA外，還以小簇的形式出現。

熒光DNA染色是另一種DNA染色方法。這種方法使用像DAPI和hoechst33258這樣的DNA染色劑來(lái)染色所有的DNA。在這個(gè)過(guò)程中需要一些專(zhuān)業(yè)知識，因為結果解釋可能很困難。支原體的低密度、其他細菌的污染或這些細菌產(chǎn)生的細胞外熒光信號都會(huì )妨礙正確的結果解釋。此外，來(lái)自核區的信號使支原體的檢測變得困難（Ligasová，2019）。這種方法一般不建議使用。