3D細胞培養的操作步驟

體外三維細胞建模和成像是候選分子毒性評估的一個(gè)有價(jià)值的早期步驟，3D細胞培養很大程度上可檢測臨床前藥物開(kāi)發(fā)工作流程，包括在細胞、組織、器官和整個(gè)有機體的迭代更高生物水平上的毒性評估。在這些層次上建模和成像的能力是分子評估和發(fā)展的強大工具。

3D細胞培養中的單個(gè)細胞提供了關(guān)于分子亞細胞對一般細胞功能的影響的數據，如細胞生長(cháng)速度。3D細胞培養也用于評估特定細胞類(lèi)型的毒性，提供組織和器官功能的數據。

3D細胞培養允許細胞生長(cháng)，培養物向各個(gè)方向擴展，從而模擬自然的微結構。這種類(lèi)型的培養提供了對分子對細胞間相互作用的影響，其方式比二維單層培養更具生理學(xué)意義。3D培養的高分辨率成像提供了分子對組織結構和完整性的影響的有價(jià)值的信息。

在藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程的早期，擁有相關(guān)的、可靠的和可預測的細胞毒性數據，可以避免可能導致臨床試驗失敗的毒性試驗，從而有助于降低用藥風(fēng)險和科研成本。

一． 實(shí)驗試劑準備：

1.準備好細胞培養試劑

2.將分裝好的Matrigel基質(zhì)膠提前24 h從-20℃放入4℃，使其融化成液體狀態(tài)；將無(wú)菌的1 mL移液器槍頭放入無(wú)菌50 mL離心管內，置-20℃冰箱預冷。

瓊脂糖包被96孔板

3.準確量取6 mL 基礎培養基于2個(gè)10 mL的注射玻璃瓶?jì)?，加?0 mg瓊脂糖，蓋塞后放入80℃的水浴鍋內加熱溶解30 min；

4.加熱結束后，將注射瓶放入滅菌鍋內，115℃滅菌30 min；

滅菌完成后，迅速取出注射瓶放入超凈臺內。將注射瓶?jì)鹊沫傊侨芤旱谷霟o(wú)菌的加樣槽中，用多通道移液器以每孔60 μL的量加入96孔板內。

注意：由于瓊脂糖溶液在室溫時(shí)會(huì )凝固，因此從滅菌鍋內取出瓊脂糖溶液后一定要快速轉移至超凈臺內并迅速加入至96孔板中。

此外，為保證加樣時(shí)瓊脂糖不冷卻，需要同時(shí)滅菌加樣槽和100 μL的移液器槍頭。

5. 加入完成后，96孔板要保持水平約30 min使孔內的瓊脂糖凝固。

配置含Matrigel基質(zhì)膠細胞懸液

二.3D細胞培養

取對數生長(cháng)期的細胞以cell systems原代視網(wǎng)膜內皮為例，胰蛋白酶消化后進(jìn)行細胞計數，用CultureBoost經(jīng)典細胞培養基將細胞懸液濃度調整至2.0×105 cells/mL，備用。

將盛滿(mǎn)碎冰的燒杯噴完酒精后放入超凈臺內，將CultureBoost經(jīng)典細胞培養基以及解凍的Matrigel基質(zhì)膠從冰箱內取出置于冰上.

注意：由于Matrigel基質(zhì)膠在室溫下溶液凝固，因此在操作過(guò)程中一定要保持低溫。

3. 將預冷的移液器槍頭取出放置于超凈臺內。根據計算量（2.5%，v/v）用移液器將300 μL Matrigel基質(zhì)膠加入到12 mL *培養基內，迅速混勻。

注意：由于Matrigel基質(zhì)膠在室溫下溶液凝固，因此使用的移液器槍頭也需要預冷。

加入步驟1中的細胞懸液（約600 μL），使細胞濃度為10000 cells/mL，迅速混勻，備用；

將細胞懸液鋪入瓊脂糖包被的96孔板

1. 將上述步驟4中配置好的含有Matrigel基質(zhì)膠的細胞懸液放入加樣槽內，用多通道移液器吸取200 μL加入到包被瓊脂糖的96孔板內。

2. 采用低溫離心機進(jìn)行離心，離心條件為4℃，1000×g，10 min,將96孔板周?chē)梅饪谀し庾　?/p>

3.人視網(wǎng)膜內皮細胞長(cháng)的比較慢在培養的第3.7和10天，并2天更換一次孔內的100ul培養基。

若要做給藥實(shí)驗，計算好OD值和IC50，配成100ul的培養基，培養成球后，吸出常規培養基換成加藥培養基即可。

Cell systems 3D培養參考文獻：

Brown JA, Pensabene V, Markov DA, Allwardt V, Neely MD, Shi M, Britt CM, Hoilett OS, Yang Q, Brewer BM, Samson PC, McCawley LJ, May JM, Webb DJ, Li D, Bowman AB, Reiserer RS, Wikswo JP. Biomicrofluidics. 2015 Sep; 9(5): 054124. doi: 10.1063/1.4934713

Herland A, van der Meer AD, FitzGerald EA, Park T-E, Sleeboom JJF, Ingber DE. PLoS ONE. 2016; 11(3): e0150360. doi: 10.1371/journal.pone.0150360