如何在WB中順利獲取大分子蛋白？

分子量大于 150Ka 的蛋白，經(jīng)常折磨我們實(shí)驗人。想當初，辛辛苦苦忙到深夜，結果發(fā)現顯影空空如也。連續幾個(gè)月如此，內心是何等抓狂。當大分子條帶第一次出來(lái)的時(shí)候，心里特別開(kāi)心，就像見(jiàn)到了初戀情人一樣?？吹街?chē)型适芾в诖蠓肿拥鞍?，想一想當初所面對的困境?nbsp;

在此,分享一下大分子蛋白的心得，希望這些經(jīng)驗對那些與大分子蛋白奮戰的童鞋提供幫助。 

提蛋白時(shí)應加入 RIPA 強效裂解液，在 4℃環(huán)境下靜置的時(shí)間延長(cháng)十分鐘到二十分鐘。這樣可以充分裂解大分子蛋白（裂解不充分，大分子蛋白的電泳速度會(huì )很慢）。電泳時(shí)，電泳的時(shí)間要足夠長(cháng)。

電泳全程采用 120-150V 的高電壓，使 Marker 拉開(kāi)足夠大的距離。電泳時(shí)要在冰水浴中進(jìn)行。 

轉膜時(shí)，濕轉法與半干轉法均可以（濕轉法獲得條帶漂亮。半干轉轉膜效率高），轉膜時(shí)，要保留分離膠（好多分子量超過(guò) 250KDa 的蛋白就殘留在濃縮膠中！這是血的教訓！當初好 幾次傻傻的把濃縮膠扔了，結果神馬條帶都沒(méi)有?。?。

先說(shuō)濕轉法，轉膜緩沖液中甲醇濃度最高 10%，加入 SDS，使 SDS 終濃度達到 5%（大于 300KDa 的蛋白，轉膜液中 SDS 的終濃度可以到 10%)。以下摸索出來(lái)濕轉法的轉膜時(shí)間（曾經(jīng)試驗過(guò) 30mA 小電流轉膜過(guò)夜的方法，PVDF 膜上神馬都沒(méi)有。建議大家不要嘗試?。?。

用半干轉時(shí)轉膜效率高。恒壓模式設置為 40V 電壓，轉膜 60-90min。一般小于 400KDa 的蛋白都能轉到 PVDF 膜上。 

或者用恒流法轉，電流大小設置為 PVDF 膜的面積，轉一個(gè)小時(shí)左右就可以出來(lái)。若怕轉膜過(guò)頭，可以將兩張 PVDF 膜重疊起來(lái)（總會(huì )有一張膜上有條帶）。 

因為多數大分子蛋白是膜蛋白，表達較少，建議延長(cháng)一抗孵育時(shí)間。有一次甚至孵育了四天才出結果。大分子蛋白與 PVDF 膜的結合不是很牢固，容易脫落，因此在洗膜時(shí)要操作輕柔，不要過(guò)于粗暴，否則抗原抗體復合物容易脫落。 

這些經(jīng)驗是從幾百次失敗的實(shí)驗中總結出來(lái)的，希望對大家有所幫助。實(shí)驗失敗不可怕， 重要的是要勇于面對，仔細思考，敢于改進(jìn)。

最后，祝大家實(shí)驗順利，早出漂亮結果！