分享總結Western跑磷酸化蛋白的要點(diǎn)

抗體 

工欲善其事必先利其器，抗體很關(guān)鍵。這里我們要說(shuō)的并不是最貴的就是好的，如果條件允許，建議同時(shí)購買(mǎi)不同廠(chǎng)家的抗體，一起來(lái)試一試，因為有時(shí)候即使是好的品牌，不同批次穩定性也不一樣?？贵w從訂購到到貨有一定的時(shí)間，所以到貨后請盡快分裝好，準備做實(shí)驗，如果實(shí)驗進(jìn)度跟不上的問(wèn)題，導致抗體到了后拖了很久才正式實(shí)驗，這樣拖了時(shí)間找廠(chǎng)家售后申訴也是很被動(dòng)的。用 CST 的一抗，效果不穩定，也可能跟抗體放久了有關(guān)。最后買(mǎi)了另一家代理的抗體算是有了比較穩定的結果。當然，還是選擇購買(mǎi)口碑較好的公司的產(chǎn)品為佳，這樣即使出了問(wèn)題售后也會(huì )跟進(jìn)。如果經(jīng)費有限，可以買(mǎi)買(mǎi)小包裝的產(chǎn)品先試試，不少抗體公司還有 5ul 的抗體試用裝免費申請。再者，孵育一抗的時(shí)候，建議用新鮮抗體，什么意思呢？很多同學(xué)因為想圖省事兒，很多時(shí)候配好孵育液，每次孵育好之后再次放進(jìn)冰箱等待下次重復利用，一些比較好跑的蛋白到時(shí)沒(méi)啥問(wèn)題，但是磷酸化的蛋白建議每次都用新鮮的抗體原液，將條帶剪下來(lái)后用雜交袋塑封 好，按 1：1000 的比例加入抗體原液孵育，再這種情況下，100ul 的抗體也是能用很久的，所以盡量每次都用新的抗體。

蛋白上樣 

普遍反映磷酸化的條帶很淡，有時(shí)候達不到制圖標準，這點(diǎn)可以加大上樣量來(lái)解決，另外，磷酸化蛋白一般與非磷酸化的蛋白一起跑一起制圖，它本來(lái)就是要比非磷酸化的要淡一些，不要過(guò)分擔心。 

電泳 

不同 kb 的蛋白電泳時(shí)間有所差別，參數啥的要用腦子更改，不能一成不變，避免發(fā)生那種蛋白跑不見(jiàn)了的慘劇。 

封閉

這個(gè)步驟非常重要，強推 BSA 封閉，不要用脫脂奶粉封閉，BSA 封閉對磷酸化的抗體效果非常好，而且也不貴。另外，BSA 封閉液倒是可以反復使用不至于向奶粉一樣臭掉，用來(lái)孵育一般非磷酸化的抗體，效果同樣棒棒噠！ 再者，封閉時(shí)間可以延長(cháng)，一般封閉 2-3 小時(shí)的情況下，可以封閉延時(shí)到 4 小時(shí)，所以按照從早到晚做實(shí)驗的時(shí)間，用 BSA 配好封閉液開(kāi)始封閉的時(shí)候，您就可以慢慢的約個(gè)火鍋唱個(gè)歌再回來(lái)了，實(shí)驗本來(lái)就很辛苦，不要再依賴(lài)外賣(mài)小哥了。 

洗膜 

嚴格遵守洗膜時(shí)間，不得減少次數，每個(gè)步驟洗 3 次，每次可以洗長(cháng)一點(diǎn)，比如（11-12 分鐘）。