如何避免掉進(jìn)做免疫組化時(shí)導致非特異性染色的八大坑？

全國江山一片紅，這可不是閱兵日的朋友圈，而是在做免疫組化??！好好的一張片子染得臟臟的。一下子整個(gè)人都不好了。這里，總結出了導致非特異性染色的八個(gè)大坑，以及避免掉坑里的一些做法。皆是獨門(mén)絕技，不要眨眼咯！

1、抗體問(wèn)題，真的是一分錢(qián)一分貨

一抗用多克隆抗體容易出現非特異性染色，建議用高純度，高效價(jià)的針對更具特異性抗原決定簇的單克隆抗體來(lái)解決。單克隆抗體很貴，不過(guò)結果真的很好。尤其是背景非特異性染色不會(huì )太深。真是一分價(jià)錢(qián)一分貨。一抗過(guò)期也會(huì )造成杯具，所以要注意抗體的有效期。

2、抗體濃度過(guò)高/孵育時(shí)間過(guò)長(cháng) 

一抗濃度太高也是出現非特異性染色的常見(jiàn)原因。解決的辦法就是預實(shí)驗。每次使用新抗體前應該多做預實(shí)驗，摸索出較為理想的工作濃度，不能簡(jiǎn)單地按照說(shuō)明書(shū)來(lái)用。另一個(gè)常見(jiàn)原因就是孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)。解決的辦法就是定時(shí)器。加上抗體后，立刻調好定時(shí)器，提醒自己及時(shí)終止反應，就會(huì )避免這個(gè)問(wèn)題。

3、DAB 染色時(shí)間太長(cháng)/變質(zhì) 

DAB 的孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)，會(huì )造成背景非特異性染色。DAB 的顯色時(shí)間不是一成不變的，主要靠自己在顯微鏡下盯著(zhù)，一旦出現淺淺的棕色的時(shí)候，就要馬上沖洗。出現棕色的時(shí)間過(guò)短，表明抗體濃度過(guò)高；出現棕色的時(shí)間過(guò)長(cháng)，表明抗體濃度過(guò)低。DAB 要保存于避光干燥的地方，現用現配，臨用前才加入 H2O2。圖 1 就沖洗的有些晚了；圖 2 就是剛剛好，染色效果棒棒噠!

4、內源性酶和生物素 

內源性酶和生物素也會(huì )造成非特異性染色，特別是一些內源性酶生物素含量豐富的組織，如肝臟，腎臟，脾臟等。處理的辦法為：滅活堿性磷酸酶：較為常用的方法是將左旋咪唑（24 mg/mL） 加入底物液中，并保持 PH 值在 7.6-8.2，即能除去大部分內源性堿性磷酸酶；對于酸性磷酸酶，可以用 50 mmol/L 的酒石酸抑制；對于內源性過(guò)氧化物酶，可以用 0.9%的雙氧水來(lái)滅活。對于內源性生物素，染色前將切片浸于 25 μg/mL 親和素溶液中 15 分鐘，PBS 清洗 15 分鐘后即可染色。也可以 24 mg/mL 的卵白素封片 15 分鐘。

5、組織變干 

一下子染太多片子的時(shí)候，容易出現這種情況。解決的辦法就是不要貪多嚼不爛。一次少染幾張。還有就是試劑充分覆蓋組織，超出組織邊緣 2 mm。然后用 PAP 筆在組織周?chē)?huà)一個(gè)圈圈，把修復液圈在里面。避免修復液流走。圈圈應該距離組織邊緣 3-4 mm。

6、浸泡時(shí)間過(guò)長(cháng) 

切片在緩沖液或修復液里面浸泡過(guò)夜，也會(huì )引起杯具。這都是偷懶的做法。但是有時(shí)候也是可以偷一下懶的。獨門(mén)秘技就是 4°C 冰箱。只要把容器放在 4°C 冰箱里，過(guò)夜*沒(méi)有問(wèn)題。

7、清洗不充分 

清洗一定要充分。PBS 液一定要雙蒸水新配，用之前再次測 PH 值。緩沖液用 0.05 mol/L 的 Tris-HCL，0.15 mol/L 的 NaCl 即可。如果加一點(diǎn)去垢劑 Tween-20 就更好了。

8、封閉血清問(wèn)題 

是否選擇了正確的封閉血清。原則是選擇二抗動(dòng)物的非免疫血清，例如二抗是羊抗兔，就要選擇非免疫羊血清。用 PBS 稀釋為 3-10%的溶液孵育切片，37°C 10-30 分鐘。這里不用洗，直接甩掉即可。再貢獻一個(gè)獨門(mén)絕招，直接用奶粉也可以。用 5%的脫脂奶粉就可以了。而且效果還不錯。怎么樣？簡(jiǎn)單吧。 

免疫組織化學(xué)是個(gè)苦活臟活。步驟多，時(shí)間長(cháng)，還要接觸有毒有害的物質(zhì)。要是好好的一張 片子染出來(lái)都是全國江山一片紅，那才叫虧大發(fā)了。以上，介紹了一些心得體會(huì )，希望對大家有所幫助。